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leyu乐鱼体育登录专业版:【前沿科普】新式核酸载体— 铁蛋白

更新时间:2022-11-04 05:54:54   来源:leyu乐鱼体育登录在线 作者:leyu乐鱼体育登录入口   

  全面展示中科院生物物理所面貌,重视研讨所科研开展,展示科技活动与奉献,立异文明及人文风貌等。

  自1937年法国科学家Laufberger初次从马的脾脏中提取别离得到铁蛋白(Ferritin)以来,铁蛋白的相关研讨至今已有近90年的前史[1]。铁蛋白是一种广泛存在于生物体内的铁贮存蛋白。其生物学功用主要是参加铁代谢,在坚持机体铁平衡和细胞抗氧化中起着重要效果。在真核细胞内,铁蛋白通常是由24个独立亚基组成的多聚体蛋白。其间,亚基类型包含重链铁蛋白(H亚基)和/或轻链铁蛋白(L亚基)。这些亚基能够自拼装构成高度有序的铁蛋白纳米笼。其外径为12 nm,内径为8 nm(图1)。凭仗共同的笼状结构,每个铁蛋白能在内腔贮存多达4500个铁原子。而不含铁核的铁蛋白则称为去铁铁蛋白(Apoferritin),现在作为药物载体被广泛研讨和使用。

  传统纳米药物载体存在生物相容性差、运送功率不抱负、毒性较强等问题。而铁蛋白作为人体内源性的天然蛋白质,其共同的蛋白笼结构以及自拼装特性为药物载体供给了新思路。阎锡蕴院士团队在十几年的铁蛋白系列研讨作业中发现,人重链铁蛋白(human heavy chain ferritin,简称HFn)是肿瘤标志分子——转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1,TfR1/CD71)的新配体。这个发现赋予了铁蛋白作为肿瘤靶向药物载体的巨大潜能。一起他们还发现,铁蛋白能够穿越血脑屏障,具有靶向医治脑瘤的新特性[2-3]。近期,该团队发现在铁蛋白笼上存在温度可控的小分子药物通道,这为处理铁蛋白药物装载的要害技术难题供给了新战略[4]。随后,该团队的相关作业证明了铁蛋白载体能有用进步多种药物的体内医医治效,一起显着下降毒副效果[5-6]。

  跟着铁蛋白研讨的深化,“铁蛋白药物载体(ferritin drug carrier,FDC)”这一新概念开端逐步被人们所熟知,在根底研讨和临床转化中也掀起了一波铁蛋白的研讨浪潮。现在,铁蛋白药物载体成功完结了对多种药物分子、成像剂以及金属纳米粒的有用装载,也广泛使用于体内投递、生物成像、疾病医治等多个生物医学范畴[6-8]。在此,咱们汇总了铁蛋白药物载体的优势,详细如下(图2):

  铁蛋白具有共同的笼状结构,其间空内腔是封装药物的抱负空间。相关研讨数据标明,铁蛋白载体具有较高药物装载率,而内腔装载的方法也能更好地保证药物在体内投递进程中的安稳性和安全性;

  铁蛋白纳米笼具有可逆的自拼装才能。因而,铁蛋白经过蛋白笼的解拼装/再拼装进程就能有用地完结药物装载。以pH介导的药物装载法为例,铁蛋白在强酸/强碱条件下, 其24聚体蛋白笼会产生解聚。而当溶液pH值康复中性时, 解聚的亚基又可重拼装为多聚体蛋白笼,一起完结药物的内部包载。此外,研讨人员还使用铁蛋白上温度灵敏的天然药物通道开发了热载法。它经过简略的温度调理就能将亲水性的小分子药物高效安稳地装载至内腔[4];

  铁蛋白具有天然的肿瘤靶向性。这赋予了铁蛋白药物载体在肿瘤靶向医治中的共同优势。研讨标明,在荷瘤小鼠体内,铁蛋白载领会高度富集在肿瘤安排。相较于游离药物,铁蛋白装载的药物在肿瘤细胞中的浓度可进步将近10倍[5];

  铁蛋白可经过大肠杆菌原核表达,易于凭借基因工程改造以完结功用化规划[9]。此外,散布在铁蛋白纳米笼外外表的赖氨酸和半胱氨酸残基可与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯或马来酰亚胺基团进行交联,然后化学偶联相应的功用组件。因而,依据使用需求,铁蛋白外外表可经过基因和化学手法进行多功用润饰,然后获得针对不同疾病的特异靶向性以及更为丰厚的医治功用;

  作为内源性蛋白,铁蛋白具有低免疫原性、高生物相容性和易于降解等优秀性质。这保证了铁蛋白药物载体在体内投递进程中的安全性,也奠定了其在生物医学范畴的转化使用根底。

  经过十余年的尽力,铁蛋白在装载化疗药物、成像剂及金属纳米粒等方面现已获得引人瞩意图开展。近年来,核酸药物逐步成为生物医药范畴重视的新焦点,而体内投递是核酸药物开展现在亟需霸占的瓶颈问题。因而,研讨人员也开端探求铁蛋白载体在核酸装载及体内投递方面的潜能。

  相较于传统药物,核酸药物具有医治靶点清晰、制备简略、耐久高效等特色,在肿瘤及遗传病医治中表现出显着的优越性。可是,现在核酸药物的转化使用却严峻受限于其体内投递问题(图3),包含(1)核酸结构的不安稳性,易被血液和安排中的核酸酶降解;(2)外源性核酸分子具有免疫原性,在体内易引发免疫铲除;(3)核酸的亲水性和负电性使其难以透过细胞膜被细胞吸取,这导致核酸药物的安排渗透性差和细胞使用率低;(4)核酸药物进入细胞后难以有用抵达效果位点[10]。毋庸置疑,核酸药物的开展亟需安全高效的核酸投递体系。

  尽管相关研讨已开发出了一系列的核酸载体,包含阳离子脂质体、阳离子聚合物、病毒载体和一些新式纳米投递体系,但这些载体潜在的安全性问题却也非常令人担忧(图4)。例如,具有高阳离子的脂质体/聚合物容易与细胞膜产生非特异性结合,然后导致体内细胞的急性损害;病毒载体所含有的病毒蛋白具有强致癌性和生物遗传毒性危险;新式纳米载体所用的人工合成资料具有显着的免疫原性及体内代谢问题等[12-13]。从现在的研制状况来看,具有高生物安全性和低免疫原性的铁蛋白是极具使用潜力的核酸载体资料。

  图4 现有核酸载体的开发现况及其存在的问题(引证BioRender资料制作)

  可是,铁蛋白作为核酸载体的开展也受限于其蛋白质结构的天然负电性,这使其难以有用装载同样带负电的核酸药物。通常状况下,铁蛋白表里表富含谷氨酸和天冬氨酸等酸性残基。这些酸性氨基酸的等电点为5.0~6.0。因而,铁蛋白内腔往往出现很高的负电荷密度。现在,已有相关研讨测验经过正电改造以进步铁蛋白的核酸亲和力[14-15],但也随之带来一些问题。例如,在铁蛋白外外表进行正电润饰或交融正电肽的战略存在一些问题,包含:(1)铁蛋白外外表性质的改动易于引发免疫原性;(2)依靠静电效果吸附在蛋白外外表的核酸在循环体系中易被强壮的血流剪切力所剥离。这会导致核酸药物的非靶标提早开释,然后引发正常安排毒性;(3)坐落铁蛋白载体外外表的核酸易与血液环境中的核酸酶相互效果,使得核酸药物降解失效。至于铁蛋白内部正电改造的现有战略,尽管内部装载能够进步核酸的安稳性,可是铁蛋白表里表交融的正电肽会占有内腔空间然后下降核酸装载量(图5)。

  为了更好地处理铁蛋白在装载核酸药物中存在的问题,近来阎锡蕴院士团队经过对铁蛋白表里表进行点骤变的方法,成功构建了具有正电内腔的铁蛋白载体HFn(+)[16]。该改造战略在不影响内腔装载空间的根底上,完结了铁蛋白表里表由“负”到“正”的改变。详细来说,研讨人员根据对铁蛋白空间结构的剖析,针对性地将坐落铁蛋白表里表的负电氨基酸——谷氨酸(Glu, D)和/或天冬氨酸(Asp, E)骤变为正电氨基酸——赖氨酸(Lys, K)和/或精氨酸(Arg, R),然后构建了一系列具有不同骤变位点和数意图内腔正电铁蛋白。随后,他们对这些骤变体的结构性质、自拼装才能、核酸装载功用和安稳性进行了体系性评价和归纳考量,从中优选了装载功率和安稳功用最佳的HFn(+) 骤变体作为铁蛋白-核酸载体。蛋白质外表电势的理论剖析及试验表征成果均显现,HFn(+) 铁蛋白骤变体的表里表电荷性显着逆转为正电主导。更为要害的是,HFn(+) 的外外表性质比较于野生型铁蛋白却根本坚持不变(图6)。这说明该改造战略能够精准地正电化铁蛋白表里表,而不搅扰铁蛋白外部性质。因而,HFn(+) 骤变体在进步核酸装载率的一起有用防止在体内引发免疫原性的危险。

  Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是肿瘤免疫激活的有用靶点之一。近年来,许多研讨标明TLR相关激活配体是极具使用潜力的抗肿瘤免疫佐剂。可是,具有核酸结构特性的TLR激活配体却囿于体内投递问题,难以在肿瘤免疫医治中大显身手。因而,在载核酸铁蛋白的使用研讨中,研讨人员选取了TLR核酸配体作为代表性核酸药物,以pH介导的解拼装/再拼装方法将其装载进铁蛋白内腔(图7)。成果显现,HFn(+) 载体能高效装载多种类型 TLR(TLR3、TLR7/8和 TLR9)的核酸配体,对不同结构的核酸具有装载普适性。更重要的是,HFn(+) 载体显着改进了TLR核酸配体的体表里投递功率,表现出高效的细胞吸取、特异的胞内定位和增强的免疫激活效果(图8)。

  使用铁蛋白共同的笼状结构和可基因/化学润饰的特性,HFn(+)载体在装载TLR核酸配体的根底上,可进一步构建为光动力(photodynamic therapy,PDT)-免疫联合医治渠道。研讨人员首要使用 pH装载法将TLR9 核酸配体CpG ODNs包载至HFn(+) 蛋白笼的内腔。随后,在HFn(+) 外外表化学润饰PDT光敏剂二氢卟吩6(Ce6)。其详细战略是,使用化学手法对Ce6的羧基进行活化,然后与铁蛋白外表氨基共价偶联。构建所得的Ce6-CpG@HFn(+)一方面能经过PDT介导肿瘤细胞的免疫原性逝世(immunogenic death,ICD),然后促进许多肿瘤相关抗原的产生及开释。另一方面CpG ODNs作为免疫佐剂可有用增强树突状细胞(dendritic cell,DC)的抗原呈递才能。二者相得益彰,协同引发体内 T 细胞活化并激活体系性抗肿瘤免疫呼应。在荷瘤小鼠模型中,Ce6-CpG@HFn(+) 显着按捺了双侧瘤成长及远端搬运的产生(图8)。更重要的是,铁蛋白-核酸载体在体表里都表现出杰出的生物安全性。

  综上,该研讨构建的内腔正电铁蛋白HFn(+) 为核酸药物供给了一个安全高效的新式体内投递体系。作为核酸载体中的新式潜力股,铁蛋白-核酸载体的开展之路仍存在着许多机会与应战。

  于此,浅述几点关于铁蛋白-核酸投递体系研讨的未来展望:(1)铁蛋白具有天然的脑靶向性和穿越血脑屏障的才能,这赋予了铁蛋白在恶性脑瘤和中枢神经体系相关疾病医治中得天独厚的优势[3]。因而,使用铁蛋白载体投递脑部疾病相关核酸药物将是一个极具远景的研讨方向;(2)胞内靶标精准投递。通常状况下,铁蛋白装载的药物会经过受体介导的细胞内吞进程进入溶酶体。因为TLR核酸配体的胞内效果位点为溶酶体,因而凭借铁蛋白载体可直接定位投递至胞内靶标。可是绝大多数现有核酸药物的胞内起效位点为胞质或细胞核,因而很有必要对铁蛋白载体进行进一步功用化规划,以完结溶酶体逃逸或直接胞质定向的细胞内吞。这样才能使铁蛋白载体普适和惠及更多核酸药物;(3)铁蛋白的内腔空间较为有限。现在铁蛋白载体仅可满意对小核酸药物的装载,关于mRNA 之类的大分子质量核酸药物仍存在装载瓶颈。因而,扩展改造现有铁蛋白载体的内腔空间、评价具有更大内腔的其他类型铁蛋白的核酸装载潜能,以及高效安全的外部装载都是范畴未来值得探求的方向;(4)除了肿瘤靶向和穿越血脑屏障等特性之外,铁蛋白作为生物内源性蛋白或许还存在其他生物学功用有待开掘,下一个新特性的发现或许就能编写出铁蛋白药物载体的新篇章。

  张宝丽,中国科学院生物物理研讨所阎锡蕴组在读博士生,研讨方向为铁蛋白药物载体及其在生物医学中的使用。

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